1 Allgemeine Methoden 1
1.1 Absorptionsmessungen 1
1.1.1 Absorptionsmessung im UV-Bereich 2
1.1.2 Absorptionsmessung im sichtbaren Bereich 3
1.1.3 Trübungsmessung 3
1.1.4 Fluoreszenzmessung 3
1.2 Radioaktivitätsmessung 4
1.3 Autoradiographie und Fluorographie 5
1.4 Zentrifugationstechniken 6
1.5 Steriles Arbeiten 7
1.5.1 Sterilisation 7
1.5.2 Steriles Arbeiten 8
1.5.3 Silikonisieren von Glasgeräten 8
1.6 Phenolextraktion 9
1.7 Fällungsmethoden 9
1.7.1 Präzipitation von Nucleinsäuren 10
1.8 Säulenchromatographische Trennverfahren für kleine Mengen Nucleinsäuren 11
1.8.1 Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose 11
1.8.2 Gelpermeationschromatographie an Sephadex G-50 oder G-100 11
1.9 Markierung von Nucleinsäuren 13
1.9.1 Endmarkierung von DNA 13
1.9.1.1 5'-Phosphorylierungen von DNA 13
1.9.1.2 3'-Endmarkierung von DNA 14
1.9.2 Radioaktive Markierung von DNA durch Nick-Translation 14
1.9.3 Markierung von DNA-Fragmenten durch "random priming" 16
1.9.4 Markierung von RNA durch In-vitro-Transkription 17
1.10 Dephosphorylierung von DNA 19
1.11 Arbeiten mit E. coli 20
1.11.1 Kultivierung von E. coli 20
1.11.2 Antibiotika 21
1.11.2.1 Genetische Marker 21
1.11.2.2 Restriktions-Modifikationssysteme von E. coli 23
1.11.2.3 Der Gebrauch des genetischen Codes 23
1.11.2.4 Keimzahlbestimmungen 24
1.12 Proteinisolierung 24
1.12.1 Chromatographische Verfahren 26
1.12.1.1 Ionenaustauschchromatographie 27
1.12.1.2 Gelpermeationschromatographie 31
1.12.1.3 Hydrophobe Chromatographie 33
1.12.1.4 Affinitätschromatographie 34
1.12.2 Fällung 36

2 Gelelektrophoresen 39
2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 39
2.1.1 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese 42
2.1.2 Gelelektrophorese in Tris-Tricin-Puffersystemen 46
2.1.3 Kontinuierliche SDS-Gelelektrophorese 47
2.1.4 Gradienten-Gelelektrophorese 48
2.1.5 Diskontinuierliche Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen 50
2.1.6 Isoelektrische Fokussierung 51
2.1.7 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese 55
2.1.8 Automatisierte Elektrophorese 58
2.2 Nachweismethoden für Proteine 58
2.2.1 Coomassie Blau-Färbung 59
2.2.2 Silberfärbung 61
2.2.2.1 Merril-Verfahren 61
2.2.2.2 Ansorge-Verfahren 62
2.2.3 Fluoreszenzfärbung 63
2.2.4 Fluoreszenzmarkierung 64
2.2.5 Detektion von Proteinen in Gelen durch SDS-Präzipitation 65
2.3 Gelelektrophorese von Nucleinsäuren 66
2.3.1 Agarose-Gelsysteme 67
2.3.1.1 Puls-Feld-Gelelektrophorese 68
2.3.1.2 Native Agarose-Gelelektrophorese für DNA 72
2.3.1.3 Denaturierende alkalische Agarose-Gelelektrophorese für DNA 74
2.3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese für RNA nach Denaturierung mit Glyoxal und DMSO 75
2.3.2 Polyacrylamid-Gelsysteme 76
2.3.2.1 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA 77
2.3.2.2 Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA 79
2.4 Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen 80
2.4.1 Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen mit Ethidiumbromid 81
2.5 Elution von Nucleinsäuren aus Gelen 82
2.5.1 Elution von DNA aus LM-Agarosegelen 83
2.5.2 Elution von DNA aus LM-Agarosegelen durch GELase(TM) 84
2.5.3 Elution von DNA aus Agarosegelen durch reversible Bindung an Glasmilch 85
2.5.4 Elektroelution von hochmolekularer DNA aus Agarosegelen 86
2.5.5 Diffusionselution von DNA aus Polyacrylamidgelen 87

3 Isolierung von DNA 89
3.1 Isolierung chromosomaler DNA 90
3.1.1 Silikagel-Technologie 91
3.1.1.1 Vollblut und Körperflüssigkeiten 93
3.1.1.2 Gewebeproben 93
3.1.1.3 Lyse weiterer Ausgangsmaterialien 94
3.1.1.3.1 Paraffin-Schnitte 94
3.1.1.3.2 Gramnegative Bakterien 94
3.1.1.3.3 Präparation von bakterieller DNA aus Augen-, Nasen- oder Rachenabstrichen 95
3.1.1.3.4 DNA-Viren 95
3.1.1.3.5 Isolierung genomischer DNA aus Bakterienkulturen (Plattenkulturen) 95
3.1.1.3.6 Suspensionskulturen 96
3.1.1.3.7 Grampositive und andere schwer lysierbare Bakterien 96
3.1.1.3.8 Hefe 96
3.1.1.3.9 Insekten 96
3.1.1.3.10 Isolierung bakterieller und parasitärer DNA aus Stuhl 96
3.1.1.3.11 Zellen aus Mundschleimhaut-, Augen-, Nasen- oder Rachen-Abstrichen 97
3.1.1.3.12 Mitochondriale DNA aus Blutplättchen 97
3.1.1.3.13 Getrocknetes Blut, cerebrospinale Flüssigkeit und Knochenmark auf Objektträgern 97
3.1.1.3.14 Genomische DNA aus Stuhl 97
3.1.1.4 Lysate jeder Art 98
3.1.2 Probenkonzentrierung 98
3.1.3 Anionenaustauscher-Technologie 98
3.1.3.1 Lyse von Blut, Buffy Coat oder Zellkulturen 100
3.1.3.2 Lyse von Geweben 100
3.1.3.3 Lyse von Hefe 100
3.1.3.4 Lyse von Bakterien 100
3.1.3.5 Isolierung genomischer DNA aus Blut, Kulturzellen, Tiergeweben, Hefen und Bakterien 101
3.2 Isolierung von Plasmid-DNA 101
3.2.1 Wichtige allgemeine Parameter 101
3.2.2 Großpräparation von Plasmid-DNA 102
3.2.2.1 Anzucht der Bakterien 103
3.2.2.2 Alkalische Lyse 103
3.2.2.3 Weitere Reinigung der Plasmid-DNA 104
3.2.2.4 Reinigung von Plasmid-DNA über CsCl-Dichtegradientenzentrifugation 105
3.2.2.5 Entfernung von genomischer DNA Kontamination 106
3.2.2.6 Analyse der Plasmid-DNA 107
3.2.3 Minipräparation von Plasmid-DNA 107
3.2.3.1 Minipräparation von Plasmid-DNA mit Silika-Technologie und Zentrifugation 108
3.2.3.2 Minipräparation von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz-Verfahren mit Anionenaustauscher-Technologie und Vakuumkammer 111
3.2.3.3 Minipräparation von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz-Format mittels Filtrationstechnologie 113
3.2.3.4 Weitere Alternativen im Bereich Minipräparation von Plasmid-DNA 115
3.2.3.5 Besonderheiten bei Minipräparationen von Plasmid-DNA 116
3.2.4 DNA-Präparation und Analyse von Plasmiden mit großem Insert (PAC, BAC) 116
3.2.4.1 DNA-Isolierung von E. coli-Zellen mit PAC- oder BAC-Plasmiden 117
3.2.4.2 Restriktionskartierung und Größenbestimmung klonierter DNA-Fragmente 119
3.2.4.3 Aufreinigung von PAC- und BAC-Insert-DNA durch präparative Puls-Feld-Gelelektrophorese 120
3.3 Isolierung von Phagen-DNA 122
3.3.1 Großpräparation von Lambda-DNA 123
3.3.1.1 Anzucht der Phagen mittels Plattenlysat 123
3.3.1.2 Anzucht der Phagen mittels Flüssiglysat 124
3.3.1.3 Protokoll zur Isolierung der Lambda-DNA 124
3.3.2 Präparation von M13-Phagen-DNA 125
3.3.2.1 Präparation von M13-Phagen-DNA durch Silikamembran-Technologie und Zentrifugation 125
3.4 Analyse von Ausbeute, Reinheit und Länge der isolierten Nucleinsäure 126

4 Isolierung von RNA 129
4.1 Arbeiten mit RNA 130
4.1.1 Arbeitsbedingungen 130
4.1.2 Vorbereiten von Geräten 130
4.1.3. RNase-Inhibitoren 130
4.1.3.1 Diethylpyrocarbonat 131
4.1.3.2 Vanadylribonucleosidkomplexe 131
4.1.3.3 RNasin/RNAguard 132
4.1.4 Ansetzen von Lösungen 132
4.1.5 Probenmaterial 133
4.2 Methoden zur Isolierung von RNA 133
4.2.1 Isolierung von RNA aus Prokaryoten 133
4.2.1.1 Grampositive Prokaryoten 133
4.2.1.2 Gramnegative Prokaryoten 134
4.2.2 Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae 135
4.2.3 Isolierung von RNA aus Pflanzenzellen 135
4.2.4 Isolierung von RNA aus tierischen Zellen 136
4.2.4.1 Isolierung von Gesamt-RNA 137
4.2.4.2 Isolierung cytoplasmatischer und nucleärer RNA 138
4.2.4.3 Isolierung von RNA aus glykoprotein- und oligosaccharidreichen Geweben 140
4.3 Isolierung von poly(A)+ - mRNA 141
4.3.1 Isolierung von poly(A)+ - mRNA durch Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-Cellulose 141
4.3.2 Isolierung mit Oligo-(dT)-Cellulose ohne Säulenchromatographie 142
4.4 Qualitätskontrolle und Lagerung der RNA-Präparation 143
4.4.1 Qualitätskontrolle einer RNA-Präparation 143
4.4.2 Lagerung von RNA 145

5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 147
5.1 Grundprinzip und Einsatzgebiete der PCR 147
5.1.1 Wesentliche Komponenten der PCR 148
5.1.2 Durchführung der PCR (Basis-Protokoll) 150
5.1.3 PCR-Geräte (Thermocycler) und Nachweissysteme für PCR-Produkte 152
5.1.4 Anwendungsgebiete der PCR 152
5.2 Verschiedene PCR-Techniken 153
5.2.1 Amplifikation von DNA 153
5.2.1.1 Hot-Start-PCR 154
5.2.1.2 High-Fidelity-PCR 155
5.2.1.3 Long-Range-PCR 156
5.2.1.4 Inverse PCR zur Amplifikation unbekannter Sequenzabschnitte 157
5.2.2 Amplifikation von RNA (RT-PCR) 158
5.2.2.1 Two-Step-RT-PCR 158
5.2.2.2 One-Step-RT-PCR 159
5.2.2.3 RACE-PCR zur Amplifikation unbekannter mRNA-Sequenzabschnitte 160
5.2.2.4 Differential-Display-PCR 162
5.2.3 Quantitative PCR und RT-PCR 163
5.2.3.1 Kompetitive RT-PCR 163
5.2.3.2 Real-Time-PCR und -RT-PCR 163
5.2.4 In-situ-PCR 167

6 Klonierung von genomischer DNA (genomische Genbank) 169
6.1 Klonierung mit dem Bakteriophagen Lambda-EMBL3 169
6.1.1 Partialhydrolyse der chromosomalen DNA 170
6.1.2 Größenfraktionierung von DNA durch Saccharose Dichtegradientenzentrifugation 171
6.1.3 Vektorhydrolyse und Ligationsreaktion 172
6.1.4 In-vitro-Verpackung der Ligationsprodukte 173
6.1.5 Titerbestimmung und Auspiattieren der Genbank 173
6.2 Klonierung mit Cosmiden 174
6.2.1 Vektorhydrolyse, Phosphatasebehandlung und Ligationsreaktion 175
6.2.2 In-vitro-Verpackung der Ligationsprodukte 176
6.2.3 Etablierung der Genbank 176
6.3 Herstellung von DNA-Bibliotheken in künstlichen, bakteriellen Chromosomen (BAC) 177
6.3.1 BAC-Vektoren 178
6.3.2 Präparation von HMW-DNA und Größenselektion der DNA-Fragmente zur Klonierung in einen BAC-Vektor 179
6.3.2.1 Präparation des BAC-Vektors 180
6.3.2.2 Plasmidaufreinigung 180
6.3.2.3 Vorbereitung des Vektor zur Ligation 180
6.3.2.4 Isolierung von Megabasen-DNA aus Pflanzen 181
6.3.2.5 Einbetten der Pflanzen-Zellkerne in Agaroseblöcke 181
6.3.2.6 DNA-Isolierung in der Agarose 182
6.3.2.7 Partieller DNA-Verdau, grobes Einstellen des Selektions-Fensters 182
6.3.2.8 Partieller DNA-Verdau, Feineinstellung des Selektionsfensters 183
6.3.2.9 Vorbereitung partiell verdauter DNA zur Ligation 183
6.3.2.10 Ligation 184
6.3.2.11 Transformation 184

7 Klonierung von cDNA (cDNA-Genbank) 187
7.1 Klonierung von cDNA mit Lambda-Vektoren 187
7.1.1 cDNA-Synthese und Vorbereitung zur Ligation 190
7.1.1.1 cDNA-Erststrangsynthese 190
7.1.1.2 cDNA-Zweitstrangsynthese 190
7.1.1.3 Auffüllreaktion 191
7.1.1.4 Eco-RI-Linkerligation und -phosphorylierung 192
7.1.1.5 Hydrolyse der cDNA 192
7.1.1.6 Größenfraktionierung der cDNA 193
7.1.1.7 Ligation der cDNA mit Lambda-Vektor-DNA 195
7.1.2 Titerbestimmung 195
7.1.3 Amplifikation 196
7.1.4 TCA-Präzipitation 197
7.2 Klonierung von cDNA mit Lambda gt11 198
7.2.1 In-vitro-Verpackung von Lambda-gt11-DNA 200
7.2.1.1 Herstellung von Verpackungsextrakt 200
7.2.1.2 In-vitro-Verpackung 202
7.2.1.3 Lagerung von Lambda-Phagenbanken und -Lysaten 202
7.2.2 Titerbestimmung 203
7.2.2.1 Überprüfung der Qualität der cDNA-Genbank durch PCR-Screening 204
7.2.3 Amplifikation 204
7.2.4 Screening der Lambda-gt11-cDNA-Bank mit Antikörpern 206
7.2.4.1 Pseudoscreening: Entfernung der Anti-E. coli- und Anti-Phagen-lmmunglobulin-Komponenten aus Antikörperseren 207
7.2.4.2 Screening mit Antikörpern und Nachscreening 208
7.2.5 Möglichkeiten eines Authentizitätsnachweises positiver Lambda-gt11-Klone 211
7.2.5.1 Isolierung des Beta-Galactosidase-Hybridproteins durch SDS-Gelelektrophorese 212
7.2.5.2 Gewinnung von Antikörpern zum Rescreening und für Western-Blots 214
7.2.6 Isolierung und Reinigung des Beta-Galactosidase-Fusionsproteins 215
7.2.6.1 Etablierung von lysogenen E. coli-Y1089-Zellen 215
7.2.6.2 Rohlysatherstellung aus lysogenen E. coli-Y1089-Zellen 216
7.2.6.3 Reinigung von Beta-Galactosidase-Fusionsproteinen aus dem Rohlysat 217
7.3 Klonierung von cDNA in Plasmide 218
7.3.1 Präparation von Plasmid-DNA mit 3'-überstehendem Thymidin 219
7.3.2 Ligation von amplifizierter cDNA mit Plasmid-DNA 219
7.3.3 Herstellung von transformationskompetenten E. coli-Zellen 220
7.3.4 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen 221

8 Blottingverfahren und Hybridisierungen 223
8.1 Transfertechniken (Blotting) 223
8.1.1 Dot-Blot 224
8.1.2 Southern-Blot 224
8.1.3 Northern-Blot 226
8.1.4 Kolonie-Transfer 226
8.1.5 Plaque-Transfer 228
8.2 Hybridisierungen 228
8.2.1 Richtlinien zur Berechnung der Schmelztemperatur bei der Hybridisierung 229
8.2.2 Richtlinien zur Hybridisierung und Markierung von Nucleinsäuren 230
8.2.3 Markierung von Oligonucleotid-Proben 232
8.2.4 Markierung von DNA durch Random-Priming oder Nick-Translation 232
8.2.5 Markierung von Proben durch PCR 232
8.2.6 Hybridisierung von Genbanken sowie Southern-Blots 233
8.2.6.1 Hybridisierung mit Oligonucleotid-Proben 235
8.2.7 Markierung von RNA-Proben 235
8.2.8 Hybridisierung von Northern-Blots 236
8.2.9 Wiederverwendung der Filter (Probenentfernung) 237
8.3 Selektion und Vereinzelung positiver Klone 238
8.3.1 Vorgehen bei Kolonie-Hybridisierungen 239
8.3.2 Vorgehen bei der Plaque-Hybridisierung 239
8.4 RNA-in-situ-Hybridisierung 240
8.4.1 Fixierung und Einbettung von Gewebe 240
8.4.2 Markierung der Sonde 241
8.4.3 Vorbereitung der Paraffinschnitte für die Hybridisierung einer RNA-Sonde 243
8.4.4 Hybridisierung 244
8.4.5 Waschen der Objektträger 244
8.4.6 Dippen der Objektträger 245
8.4.7 Entwicklung der Objektträger 246

9 Transfektion von Säugerzellen 249
9.1 Einführung 249
9.1.1 Chemische Transfektionsmethoden 249
9.1.2 Physikalische Transfektionsmethoden 251
9.1.3 Biologische Transfektionsmethoden 252
9.1.4 Methoden zur Steigerung von Genexpression und Transfektionseffizienz 256
9.1.5 Stabile Expression und Genamplifikation 256
9.2 Zellkulturmethoden 257
9.2.1 Beschichtung von Kulturgefäßen 257
9.2.2 Kultivierung von Säugerzellen am Beispiel der Fibroblastenzelllinie BHK 21 257
9.2.3 Subkultivierung von BHK 21 258
9.2.4 Zellzählung durch den Trypanblau-Ausschlusstest 258
9.2.5 Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen 259
9.2.6 Herstellung von Zellextrakten durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen 259
9.2.7 MTT-Test 260
9.2.8 Bestimmung der Geneticintoleranzdosis 260
9.3 Transfektionsmethoden 261
9.3.1 Versuchsplanung 261
9.3.2 Calciumphosphat-Transfektion 262
9.3.3 DEAE-Dextran-Transfektion 263
9.3.4 Transfektion mit aktivierten Dendrimeren 263
9 Lipofektion 264
9.3.5.1 Herstellung der Liposomen 264
9.3.5.2 Lipofektion mit DDAB- oder DOTAP-Liposomen 266
9.3.5.3 Lipofektion mit kommerziell erhältlichen Lipofektionsreagenzien 267
9.3.6 Elektroporation 267
9.3.7 Transfektion mit komplexen Transfektionsreagenzien 268
9.3.8 Transfektion bestimmter Zelltypen mit speziell optimierten Transfektionsreagenzien 268
9.4 Nachweis der Expression und Bestimmung der Transfektionseffizienz 269
9.4.1 Nachweis von Beta-Galactosidase mittels X-Gal-Färbung 269
9.4.2 Nachweis von Beta-Galactosidase in Zellextrakten 269
9.4.3 Messung von Luciferaseaktivität in Zell-Lysaten 270
9.4.4 Bestimmung der Transfektionseffizienz 270
9.4.5 Selektion auf stabile Expression und Isolierung resistenter Klone 271
9.5 Trouble shooting 272
9.5.1 Tipps und Tricks 273

10 Genexpression in E.coli und Insektenzellen: Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine 279
10.1 Vorüberlegungen; Auswahl von Wirtszelle und Expressionsvektor 280
10.2 Expression eines eukaryotischen GST-Fusionsproteins in E. co 281
10.2.1 Konstruktion des Expressionsvektors 282
10.2.2 Expression des GST-Fusionsproteins 283
10.2.3 Reinigung des GST-Fusionsproteins 284
10.2.4 Spaltung eines GST-Fusionsproteins 285
10.3 Baculovirus-System: Expression eines eukaryotischen Proteins in Insektenzellen 286
10.3.1 Konstruktion des Expressionsvektors 288
10.3.2 Herstellung der rekombinanten Bacmid-DNA zur Transfektion von Insektenzellen 289
10.3.3 Kultivierung und Infektion der Insektenzellen 291
10.3.4 Transfektion von 5f9-Insektenzellen mit rekombinanter DNA 292
10.3.5 Bestimmung günstiger Expressionsparameter 292
10.3.6 Bestimmung des viralen Titers über Plaquetest 293
10.3.7 Reinigung eines sekretierten Expressionsprodukts mit His-tag unter nativen Bedingungen 295
10.3.8 Reinigung eines nichtsekretierten Expressionsprodukts mit His-tag unter denaturierenden Bedingungen 296

11 Das Pichia pastoris-Expressionssystem 299
11.1 Die Theorie des Pichiapastoris-Systems 299
11.1.1 Vergleich mit anderen Expressionssystemen 299
11.1.2 Pichia pastoris-Expressionsvektoren 300
11.1.3 Transformation und Integration der rekombinanten Vektoren ins Pichia pastoris-Genom
11.1.4 Mehrfache Vektorinsertionen 302
11.1.5 Pichiapastoris-Wirtsstämme 303
11.2. Proteinexpression mit dem Pichia pastoris-System 304
11.2.1 Transformation von Pichia pastoris 305
11.2.1.1. Elektroporation von Pichia pastoris 305
11.2.1.2. LiCI-Transformation von Pichia pastoris 306
11.2.2 Analyse des Mut-Phänotyps rekombinanter P. pastoris-Klone 307
11.2.3 Selektion von Pichia pastoris-Klonen mit mehrfachen Vektorinsertionen 308
11.2.4 Isolierung genomischer DNA von rekombinanten Pichia pastoris-Klonen 309
11.2.5 Proteinproduktion und Durchmusterung vieler Pichia pastoris-Klone 310
11.2.6 "Upscaling" und Präparation von Rohmembranen 312
11.2.7 Lagerung von Pichia pastoris 314

12 Genexpression in Aspergilusniger, A. awamoriund A. oryzae 317
12.1 Herstellung von A. niger-, A.-awamori- und A. oryzae- Protoplasten 317
12.2 Transformation von A. niger- und A. awamori-Protoplasten 318
12.3 Transformation von A. oryzae-Protoplasten 319

13 Verminderung der Genexpression über Ribozym-Targeting 323
13.1 Vorüberlegungen zur Ableitung von Ribozymen 324
13.2 Herstellung von Ribozymen gegen den HER-2 (c-erbB2)-Rezeptor 325
13.2.1 Identifizierung geeigneter Zielsequenzen und Ableitung der Ribozym-Sequenzen 326
13.2.2 Auswahl des Expressionsvektors und Klonierung der Ribozyme 327
13.2.3 Herstellung stabiler Ribozym-transfizierter Zelilinien mit konstitutiver Ribozym-Expression 328
13.2.4 Analyse und Vergleich der Ribozym-Aktivität 329

14 In vitro Mutagenese 331
14.1 Einleitung 331
14.1.1 Mutagenesetechniken 331
14.1.2 Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis) 332
14.1.3 Mutagenese-Primer 333
14.1.4 Grundsätzliches am Arbeitsplatz 333
14.2 Protokolle 334
14.2.1 Gerichtete Mutagenese durch Überhangverlängerung 334
14.2.2 Zirkuläre Mutagenese und Dpn I-Selektion der Mutanten 337
14.3 Zusatzinformationen 341
14.3.1 Kommerzielle Kits für die Mutagenese 341
14.3.3 Nützliche Links 342
14.3.2 Komerzielle Produkte zum DNA clean up 342

15 Protein-Blotting und Nachweis membrangebundener Proteine 343
15.1 Vorbereitung der Proben 344
15.2 Gelelektrophoretische Trennung des Proteingemisches 345
15.3 Gel-Blot: Elektrophoretischer Transfer in Wet- und Semi-Dry-Verfahren 346
15.4 Dot-Blot 351
15.5 Optional: Färbung der transferierten Proteine 352
15.6 Nachweisreaktion: Bindung der Erst- und Zweit-Antikörper 354
15.7 Visualisierung: Farb- oder Chemilumineszenzreaktion 359
15.8 Trouble Shooting 364

16 Identifizierung und Charakterisierung von DNA-Bindeproteinen 369
16.1 Präparation von Proteinextrakten aus Säugerzellen 370
16.1.1 Präparation von Zellkernextrakten 371
16.1.2 Präparation von cytoplasmatischen Extrakten 372
16.1.3 Kurzprotokoll zur Präparation von Proteinkernextrakten 372
16.2 Bandshift-Analyse 373
16.2.1 Selektion von DNA-Fragmenten 374
16.2.2 Radioaktive Markierung der DNA-Fragmente 375
16.2.3 Bandshift-Reaktion 376
16.2.4 Nachweis der DNA-Bindeproteine durch native PAA-Gelelektrophorese 376
16.2.5 Charakterisierung der Bindespezifität der DNA-Bindeproteine 377
16.3 South-Western-Blot 378
16.4 Reinigung von DNA-Bindeproteinen 380
16.4.1 DNA-Affinitätschromatographie 381
16.4.1.1 Phosphorylierung und Ligation der DNA-Fragmente 381
16.4.1.2 Kopplung der DNA-Fragmente an die Säulenmatrix 382
16.4.1.3 Affinitätschromatographie 383
16.5 Funktionelle Analyse von Transkriptionsfaktoren 384

17 Text- und sequenzbasierte Datenbankabfragen in der Bioinformatik 387
17.1 Allgemeine Datenbankabfragen 388
17.1.1 Molekularbiologische Datenbanken 388
17.1.1.1 DNA-Sequenzdatenbanken 389
17.1.1.2 Proteinsequenz-Datenbanken 389
17.1.1.3 Charakteristische Sequenzbereiche/Sequenzmotive 389
17.1.1.4 3D-Strukturdatenbanken 390
17.1.1.5 Literaturdatenbanken 390
17.2 Textbasierte Suche 392
17.2.1 NCBT und Entrez 392
17.2.2 EBI und SRS 394
17.2.3 Anwendungsbeispiel 397
17.3 Sequenzinformationen 398
17.3.1 Internet-Portale 398
17.3.2 DNA-Sequenzen 399
17.3.2.1 DNA-Sequenzbausteine 399
17.3.2.2 Sequenzformate 399
17.3.3 Anwendungsbeispiele 400
17.3.3.1 Datenbankrecherchen mit BLAST 400
17.3.3.2 Domänen-Strukturanalysen 402
17.3.3.3 Restriktionsanalyse als Basis der Klonierung 403
17.3.3.4 Auswahl von PCR-Primern 404
17.3.3.5 Vergleich zweier Sequenzen (Align, dotplot) 404
17.3.3.6 Vergleich mehrerer Sequenzen untereinander mit CLUSTALW 405
17.3.3.7 Bestimmung der offenen Leseraster in einer Sequenz 406
17.3.3.8 Analyse repetitiver Sequenzen 407
17.4 Anhang 408

18 DNA-Microarrays 411
18.1 Herstellen von Microarrays mit synthetischen Oligonucleotiden (70meren) 413
18.1.1 Spotting von 7omer-Oligonucleotiden auf Glasträger 414
18.1.1.1 Vorbereitung der Glasträger 414
18.1.1.2 Auftragen der Sonden (Spotting) 415
18.1.1.3 Nachbehandlung der Microarrays 416
18.1.2 Markierung und Hybridisierung der Zielmoleküle (Targets) 417
18.1.2.1 cDNA-Synthese und Markierung der Targets 417
18.1.2.2 Hybridisierung der Microarrays 420
18.2 Expressionsanalyse mit cDNA-Microarrays 421
18.2.1 cDNA Microarray Expressionsanalyse ausgehend von Gesamt-RNA 422
18.2.1.1 Präparation von Gesamt-RNA 422
18.2.1.2 DNase-Behandlung von Gesamt-RNA 424
18.2.1.3 Präparation von radioaktiv markierter cDNA ausgehend von Gesamt-RNA nach Anreicherung von PolyA+RNA 424
18.2.1.4 cDNA-Microarray-Analyse 426
18.2.2 cDNA Microarray Expressionsanalyse ausgehend von PolyA+RNA 428
18.2.2.1 Präparation von radioaktiv-markierter cDNA ausgehend von PolyA+RNA 428
18.2.2.2 cDNA-Microarray-Analyse 430
18.2.3 cDNA-Microarray-Expressionsanalyse ausgehend von Gesamt-RNA (Direktmethode) 430
18.2.3.1 Präparation der radioaktiv markierten cDNA von Gesamt-RNA 431

19 Peptidarrays auf Cellulosemembranen 433
19.1 Synthese der filtergebundenen Peptidbibliothek 433
19.1.1 Aminoderivatisierung des planaren Trägers und Definition der Spots 434
19.1.2 Synthese der Peptidkette 435
19.1.3 Absättigen der fertigen Peptide und Entschützen der Aminosäureseitenketten 436
19.1.4 Praktische Vorbeitungen 437
19.1.5 Praktische Durchführung 442
19.1.5.1 Planung der Bibliothek 442
19.1.5.2 Routine-Arbeitsschritte 443
19.1.5.3 Derivatisierung des Cellulose-Trägers 444
19.1.5.4 Definition der Spots und Verlängerung des Beta-Alanin-Ankers 446
19.1.5.5 Synthesezyklus 447
19.1.5.6 End-Capping und Abspaltung der Aminosäureseitenkettenschutzgruppen 448
19.1.5.7 Lagerung der Peptidbibliothek 449
19.2 Screening der Peptidbibliothek 449
19.2.1 Durchführung des Screenings 450
19.3 Regeneration (Stripping) der Peptidbibliothek 452
19.3.1 Praktische Vorbereitungen 452

Anhang 1 Sequenzierung von DNA 457

A 1.1 Vorüberlegungen 459
A 1.2 Vorbereitung der DNA zur Sequenzierreaktion 460
A 1.2.1 Spermin-Präzipitation 460
A 1.3 Sequenzierreaktion 461
A 1.3.1 Basisprotokoll 461
A 1.3.2 Alternativprotokoll: Sequenzierung in Mikrotiterplatten 462
A 1.3.3 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I 463
A 1.3.4 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit thermostabilen DNA-Polymerasen 464
A 1.3.5 Alternativprotokoll: Zyklus-Sequenzierung (thermal cycle sequencing) 465
A 1.3.6 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit 5'-markierten Primern 466
A 1.3.7 Hinweise zur Sequenzierung mit Fluorophor-derivatisierten Didesoxynucleotidtriphosphaten ("dye terminator sequencing") 469
A 1.3.8 Hinweise zur direkten Sequenzierung von PCR-Produkten 469
A 1.4 Gelelektrophorese 470
A 1.4.1 Herstellung des Sequenziergels 471
A 1.4.2 Elektrophorese 473
A 1.4.3 Gelbehandlung und Exposition eines Gels mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten 474
A 1.4.4 Allgemeine Hinweise zur Gelelektrophorese 475
A 1.4.5 Lesen der Sequenz 476
A 1.4.6 Trouble Shooting 476
A 1.5 Verwendung von automatischen DNA-Sequenziergeräten 477

Anhang 2 Proteinsequenzierung 481

A 2.1 Alkylierung von Cysteinresten 481
A 2.1.1 Alkylierung mit Acrylamid 482
A 2.1.2 Entsalzungsmethoden 482
A 2.1.2.1 Entsalzung mit ProSorb(TM) 483
A 2.1.2.2 Tonenpaarextraktion mit gleichzeitiger Fällung 483
A 2.2 Fragmentierung von Proteinen und Peptiden 484
A 2.2.1 Chemische Spaltungen 485
A 2.2.1.1 Spaltung mit Bromcyan 486
A 2.2.1.2 Partielle Säurehydrolyse mit Ameisensäure 488
A 2.2.2 Enzymatische Hydrolysen mit Endoproteinasen 488
A 2.2.2.1 Spaltung mit Trypsin 489
A 2.2.2.2 Spaltung mit Endoproteinase Lys-C 489
A 2.2.3 Mikromethoden 490
A 2.2.3.1 Enzymatische Fragmentierung im Gel 490
A 2.2.3.2 Enzymatische Fragmentierung von der PVDF-Membran 491
A 2.3 Endgruppenbestimmung mittels Carboxypeptidasen 492
A 2.4 Isolierung von Peptiden 494
A 2.4.1 Peptidtrennung mittels HPLC 494
A 2.4.2 Peptidtrennung mittels Elektrophorese 495
A 2.4.2.1 Elektroblotting auf PVDF-Membranen 495
A 2.5 Aminosäurenanalyse 496
A 2.5.1 Hydrolyse 497
A 2.5.2 Derivatisierung 497
A 2.6 Automatisierte Sequenzanalyse von Proteinen 498
A 2.6.1 N-terminale Sequenzierung 499
A 2.6.1.1 Chemischer Abbau im Sequenzierautomaten nach Edman 499
A 2.6.1.2 N-terminale Leitersequenzierung: Kopplung von Massenspektrometrie und Edman-Chemie 500
A 2.6.2 C-terminale Sequenzierung 500
A 2.6.2.1 C-terminaler Abbau im Sequenzierautomaten 501
A 2.6.3 Sequenzierung mittels Massenspektrometrie 501
A 2.6.4 Andere massenspektrometrische Verfahren 502
A 2.7 Zusammenfassung 503